原理
本實驗采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 AKT 單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的 AKT與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗大鼠AKT，形成**復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍色，*后加終止液硫酸，在450nm處測OD值，AKT濃度與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中AKT濃度。
試劑盒組成（2-8℃保存）
酶標板（CoatedWells） | 96孔 | 酶標抗體工作液（Enzyme Conjugate） | 12ml |
10×標本稀釋液（SampleBuffer） | 12ml | 20×濃縮洗滌液（WashBuffer） | 50ml |
標準品（Standards）：100uM/瓶 | 2瓶 | 底物工作液（TMB Solution） | 12ml |
**抗體工作液（Biotinylated Antibody） | 12ml | 終止液（StopSolution） | 12ml |
準備試劑與收集血樣
1. 收集標本：血清、血漿（EDTA、檸檬酸鹽、肝素抗凝）、細胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿等盡早檢測，2-8℃保存48小時；更長時間須冷凍（-20℃或-70℃）保存，避免反復凍融。
2. 標準品液配制：使用前加入0.5ml蒸餾水混勻，配成200uM/L的溶液。設標準管8管，**管加標本稀釋液900ul，**至第八管加入標本稀釋液500ul。在**管中加入200uM/L的標準品溶液100ul混勻后用加樣器吸出500ul，移至**管。如此反復作對倍稀釋，從第七管中吸出500ul棄去。第八管為空白對照。
3. 10×標本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。
4. 洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）
檢測程序
1. 加樣：每孔各加入標準品或待測樣品100ul，將反應板充分混勻后置37℃120分鐘。
2. 洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4-6次，向濾紙上印干。
3. 每孔中加入**抗體工作液100ul。將反應板充分混勻后置37℃60分鐘。
4. 洗板：同前。
5. 每孔加酶標抗體工作液100ul。將反應板置37℃30分鐘。
6. 洗板：同前。
7. 每孔加入底物工作液100ul，置37℃暗處反應15分鐘。
8. 每孔加入100ul終止液混勻。
9. 30分鐘內(nèi)用酶標儀在450nm處測吸光值。
結(jié)果計算與判斷
1. 所有OD值都應減除空白值后再行計算。
2. 以標準品20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0uM/L為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線。
3. 根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應AKT含量。
試劑盒性能
1. 靈敏度：*小的AKT檢測濃度小于0.2uM/L。
2. 特異性：可同時檢測重組或天然的大鼠AKT。不與大鼠其它細胞因子有交叉反應。
3. 重復性：板內(nèi)、板見變異系數(shù)均小于10.3％。
注意事項
1. 以上標準孔及待測樣品均建議做復孔，每次測定應同時做標準曲線。
2. 洗滌過程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導致**度誤差及OD值錯誤地升高。
3. 板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。
4. 本試劑盒宜置4oC冰箱保存。
4. 本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！
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